Sekwencjonowanie całego genomu a genotypowanie

Zależy od jakości, a nie od ilości danych

Kwas dezoksyrybonukleinowy, w skrócie DNA, jest nośnikiem informacji genetycznej i znajduje się w jądrze niemal każdej komórki naszego ciała. Możemy go sobie wyobrazić jako „książkę z przepisami”, w której poszczególne przepisy reprezentują geny. Dzięki genomom komórka potrafi wytworzyć produkty końcowe, którymi w większości przypadków są białka. Te z kolei pełnią w naszym organizmie różne funkcje, od budulcowych, regulacyjnych i transportowych po wiele innych. Jeśli w tych przepisach (genach) pojawi się jakiś błąd, produkt końcowy może mieć inne właściwości lub w ogóle nie powstać. Błędy te nazywamy „mutacjami” i to właśnie one w dużej mierze odpowiadają za różne różnice w naszym organizmie.

To, co konkretnie jest zapisane w tych „przepisach”, udało nam się odkryć dopiero na początku tego stulecia, kiedy to naukowcy zsekwencjonowali cały ludzki genom. Składa się on z około 3 miliardów elementów budulcowych, które nazywamy tzw. „nukleotydami”. Cała sekwencja DNA składa się z 4 podstawowych nukleotydów – adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy. Z tego powodu w sekwencji DNA spotykamy litery A, G, C i T. Sam ciąg liter nic nam jednak nie mówi. Dzisiaj wiemy już, że geny stanowią jedynie około 2% ludzkiego genomu, a mamy ich około 20 000. Reszty w zasadzie nie znamy, choć wiemy, że również w tej części znajdują się obszary istotne dla prawidłowego funkcjonowania naszych komórek.

Jak bardzo różnimy się od siebie z punktu widzenia genetyki?

Nasze DNA jest identyczne w 99,9%. Na pierwszy rzut oka może się wydawać, że prawie się nie różnimy. Jeśli jednak weźmiemy pod uwagę wielkość naszego genomu, okaże się, że różnimy się w około 3 milionach nukleotydów. I właśnie te miejsca, w których w populacji występują różne litery, są przedmiotem ogromnego zainteresowania wielu badań. Dzięki tym badaniom wiemy dziś na przykład, że jeśli w konkretnym miejscu w DNA występuje u Ciebie jakaś konkretna litera, to masz zwiększoną genetyczną predyspozycję do rozwoju jakiejś choroby. Dzięki ogromnemu postępowi w dziedzinie „odczytywania” DNA niemal każdy ma dziś możliwość zajrzenia bezpośrednio do swoich komórek, do sekwencji swojego DNA. Jest to naprawdę fenomenalne osiągnięcie nauki, biorąc pod uwagę, że jeszcze na początku tego stulecia zsekwencjonowanie jednego ludzkiego genomu kosztowało około 3 miliardów dolarów i trwało 13 lat. Dzisiaj koszt sekwencjonowania jednego genomu spadł poniżej 1000 dolarów, a samo sekwencjonowanie trwa zaledwie kilka minut.

Obecnie stosuje się głównie dwie metody analizy DNA – sekwencjonowanie i genotypowanie.

Sekwencjonowanie

Jedną z technik stosowanych do określenia sekwencji DNA jest tzw. sekwencjonowanie, czyli ustalenie kolejności nukleotydów w genomie danej osoby. Obecnie stosuje się głównie dwa podejścia, a mianowicie tzw. sekwencjonowanie całego eksomu i całego genomu.

Sekwencjonowanie całego eksomu

Technologia sekwencjonowania całego eksomu skupia się wyłącznie na konkretnych fragmentach genomu, które dostarczają informacji niezbędnych do syntezy białek. Zakłada się, że te fragmenty, zwane „eksonami”, stanowią około 1% ludzkiego genomu. Wszystkie eksony w genomie razem nazywane są „eksonomem”, dlatego też metoda ich sekwencjonowania znana jest jako sekwencjonowanie całego eksonomu. Podejście to pozwala zidentyfikować mutacje w regionie kodującym dowolnego genu, a nie tylko w kilku wybranych genach. A ponieważ większość znanych mutacji powodujących choroby występuje właśnie w eksonach, ta metoda sekwencjonowania jest skuteczna w identyfikacji takich potencjalnych mutacji.

Sekwencjonowanie całego genomu

Wiadomo jednak, że również mutacje poza obszarami eksonów mogą wpływać na aktywność genów i syntezę białek, a tym samym prowadzić do różnych chorób. Właśnie dlatego najdoskonalszą metodą jest sekwencjonowanie całego genomu, które określa kolejność niemal wszystkich nukleotydów w genomie danej osoby.

Obecnie najczęściej stosowaną metodą jest tzw. sekwencjonowanie ILLUMINA, dzięki któremu powstało ponad 90% wszystkich danych sekwencjonowania na świecie. Nazwa tej metody nawiązuje do amerykańskiej firmy, która zajmuje się opracowywaniem, produkcją i sprzedażą systemów do analizy zmienności genetycznej i funkcji biologicznych oraz która wprowadziła tę metodę na rynek. Metoda ta opiera się na wykrywaniu poszczególnych nukleotydów (A, G, C i T) po ich wbudowaniu w rosnące łańcuchy DNA. Wykrywanie nukleotydów opiera się na sygnale fluorescencyjnym, co oznacza, że każdy nukleotyd jest oznaczony pewnym znacznikiem fluorescencyjnym (można to sobie wyobrazić jako kolorowy znacznik), a po dodaniu go do łańcucha komputer analizuje dany sygnał.

Czy jednak wystarczy odczytać cały genom tylko raz?

Obecnie nie jesteśmy jeszcze na etapie, na którym wystarczyłoby odczytać cały ludzki genom tylko raz. W chwili obecnej nie istnieją bowiem na tyle precyzyjne metody sekwencjonowania, aby podczas jednego odczytu bezbłędnie odczytać cały genom. Właśnie z tego powodu firma ILLUMINA zaleca co najmniej 30-krotne pokrycie. Oznacza to, że średnio każdy nukleotyd jest odczytywany niezależnie 30 razy.

Niektóre firmy oferują jednak obecnie sekwencjonowanie całego genomu przy znacznie mniejszym pokryciu, w niektórych przypadkach nawet przy pokryciu wynoszącym zaledwie 1x. W przypadku sekwencjonowania o tak niskim pokryciu odczytanie całego genomu jest obecnie niemożliwe. Jak zatem można ułożyć całą układankę, skoro w odczycie brakuje niektórych elementów?

Proces ten jest dość złożony, ale w uproszczeniu opiera się na zasadzie tzw. „imputacji”. W ten sposób uzupełnia się statystycznie nieodczytane fragmenty na podstawie znanych haplotypów występujących w populacji. Wykorzystuje się tu fakt, że poszczególne nukleotydy nie są dziedziczone osobno, lecz wspólnie w grupach, które nazywamy „haplotypami”. Aby jednak sekwencjonowanie o tak niskim pokryciu można było uznać za miarodajne, konieczne jest posiadanie dużego i specyficznego dla danej populacji panelu referencyjnego, na podstawie którego możliwe będzie uzupełnienie brakujących fragmentów genomu danej osoby z dużą dokładnością. Jednak nawet przy spełnieniu tych warunków podejście to nie nadaje się do analizy bardzo rzadkich wariantów genetycznych.

Sekwencjonowanie określonych genów

W praktyce klinicznej często nie sekwencjonuje się całego genomu ani eksomu, lecz jedynie konkretne, wybrane fragmenty – a mianowicie określone geny. To badanie diagnostyczne stanowi skuteczne narzędzie pozwalające potwierdzić lub wykluczyć występowanie konkretnej mutacji patogennej prowadzącej do poważnej choroby, która częściej występuje w historii rodzinnej danego pacjenta.

Genotypowanie

Mimo że sekwencjonowanie całego genomu zapewnia nam najlepszy obraz naszego genomu, nadal należy ono do stosunkowo kosztownych metod. Właśnie dlatego w komercyjnych testach DNA stosuje się obecnie przede wszystkim metodę tzw. genotypowania, ze względu na jej efektywność pod względem stosunku ceny do wydajności. Polega ona na analizie konkretnych miejsc w DNA na chipie. W odróżnieniu od sekwencjonowania całego genomu nie odczytuje się więc całego DNA, a jedynie konkretne miejsca, które zostały wybrane na podstawie tego, czy coś o nich wiemy, a zatem czy potrafimy je z czymś powiązać. Miejsca te obejmują na przykład mutacje związane z różnymi chorobami lub z potencjałem sportowym.

Które podejście jest zatem obecnie bardziej odpowiednie w przypadku komercyjnych badań genetycznych?

Jak już wspomniano powyżej, sama sekwencja nukleotydów w genomie nic nam nie mówi; kluczowe znaczenie ma powiązanie konkretnych zmian z konkretnymi cechami.

Sekwencjonowanie całego genomu zapewnia wprawdzie najbardziej kompleksowy obraz genomu danej osoby, jednak musi być przeprowadzone w sposób wysokiej jakości, z wystarczająco dużym pokryciem. Jest to jednak nadal stosunkowo kosztowne, a biorąc pod uwagę fakt, że obecnie nie znamy funkcji większości miejsc w genomie, nie możemy dziś uznać tego podejścia za skuteczne w przypadku komercyjnych badań genetycznych.

W przypadku genotypowania nie analizuje się całego genomu, a jedynie wybrane miejsca o znanej funkcji, w których często różnimy się od siebie. To skuteczne podejście pozwoliło obniżyć cenę badań genetycznych na tyle, że stały się one odpowiednim narzędziem do zastosowań komercyjnych. Właśnie dlatego my w DNA ERA również stosujemy to podejście w naszych testach DNA.

Źródła:

1. Li, Y., Willer, C., Sanna, S., & Abecasis, G. (2009). Genotype imputation. Annual review of genomics and human genetics, 10, 387-406.
2. Shendure, J., Balasubramanian, S., Church, G. M., Gilbert, W., Rogers, J., Schloss, J. A., & Waterston, R. H. (2017). DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature, 550(7676), 345-353.
3. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html

Źródła zdjęć:

1. https://www.freepik.com/photos/technology‘>Technology photo created by freepik – www.freepik.com
2. https://en.wikipedia.org/wiki/$1,000_genome#/media/File:Cost_per_Genome.png